高效液相色譜儀HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下（不包括梯度），峰型應(yīng)對稱而尖銳。但是，在對樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理下，會出現(xiàn)各種意想不到的問題，本文主要說明色譜雙峰可能的原因及處理方法。 

色譜雙峰可能的原因有三種。

1、色譜柱

如果你分析樣品時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質(zhì)時，可以肯定色譜柱出問題，柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。

如果進(jìn)樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。

當(dāng)然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進(jìn)樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應(yīng)柱效很低而報廢。

2、溶劑極性及進(jìn)樣量

許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻(xiàn)都不會提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。

樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。

當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時間會提前（相對進(jìn)樣量少而言），將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎?。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。

上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進(jìn)樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了，這是由于進(jìn)樣量過大，色譜柱過載造成的。

3、樣品的特性

有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個動態(tài)平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如紅霉素等。

有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC－MS下，用質(zhì)譜檢測器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如農(nóng)藥啶蟲瞇（吡蟲清）。

（內(nèi)容來源儀器信息網(wǎng)）