分光光度計在核酸蛋白定量的應用常識
點擊: 次 時間:2017-01-21 10:50
分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。
分光光度計的簡單原理
分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，而后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實上，分光光度計的設計和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準確度和精確度。如Biophotometer的準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高(超過光度計的測試范圍)。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負值;混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。
除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。
蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)
這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的“背景”信息，設定此功能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾;另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸(如酪氨酸，絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數(shù)目直接相關，從而反應蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以最早期的Biuret 反應為基礎，并有所改進。蛋白質(zhì)與Cu2+反應，產(chǎn)生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑;反應需要的時間較長;容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
BCA(Bicinchoninine acid assay)法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應產(chǎn)生Cu+，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強，反應后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍;操作更簡單，速度更快;只需要一種反應試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時，方便結(jié)果;而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑(如DTT，巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry，BCA 測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA作標準品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標準品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構(gòu)成，尋找化學構(gòu)成類似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應后1011分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品(包括標準樣品)，都必須在此時間內(nèi)測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因為反應后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。
細菌細胞密度(OD 600)
實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細胞計數(shù)，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細菌培養(yǎng)一段時間后，與培養(yǎng)基反應，發(fā)生變色反應。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態(tài)。
分光光度計的重要配件—— 比色杯
比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、 玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的 測量體積，有比色杯和毛細比色杯等。
一般測試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因為反應中的染料(如考馬斯亮蘭)能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測試樣品。
由于另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量，亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl，比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如塑料比色杯，是目前比色杯市場上一個革新。隨著生命科學以及相關學科發(fā)展，對此類科學的實驗研究提出更高的要求，分光光度計將是分子生物實驗室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關實驗室的必備設備之一
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分光光度計的簡單原理
分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，而后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實上，分光光度計的設計和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準確度和精確度。如Biophotometer的準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高(超過光度計的測試范圍)。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負值;混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。
除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。
蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)
這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的“背景”信息，設定此功能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾;另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸(如酪氨酸，絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數(shù)目直接相關，從而反應蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以最早期的Biuret 反應為基礎，并有所改進。蛋白質(zhì)與Cu2+反應，產(chǎn)生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑;反應需要的時間較長;容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
BCA(Bicinchoninine acid assay)法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應產(chǎn)生Cu+，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強，反應后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍;操作更簡單，速度更快;只需要一種反應試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時，方便結(jié)果;而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑(如DTT，巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry，BCA 測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA作標準品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標準品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構(gòu)成，尋找化學構(gòu)成類似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應后1011分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品(包括標準樣品)，都必須在此時間內(nèi)測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因為反應后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。
細菌細胞密度(OD 600)
實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細胞計數(shù)，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細菌培養(yǎng)一段時間后，與培養(yǎng)基反應，發(fā)生變色反應。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態(tài)。
分光光度計的重要配件—— 比色杯
比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、 玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的 測量體積，有比色杯和毛細比色杯等。
一般測試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因為反應中的染料(如考馬斯亮蘭)能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測試樣品。
由于另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量，亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl，比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如塑料比色杯，是目前比色杯市場上一個革新。隨著生命科學以及相關學科發(fā)展，對此類科學的實驗研究提出更高的要求，分光光度計將是分子生物實驗室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關實驗室的必備設備之一
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