摘要

本文通過在線光化學(xué)衍生-高效液相色譜法，同時測定火鍋底料中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B。樣品經(jīng)丙酮和乙腈的混合溶液（V:V/2:8）提取、C18固相萃取柱凈化、高效液相色譜分離后，4種蘇丹紅染料在紫外光的照射下發(fā)生衍生反應(yīng)，衍生產(chǎn)物進(jìn)入熒光檢測器測定，外標(biāo)法定量。

1 前言

"蘇丹紅"是一種化學(xué)染色劑，并非食品添加劑。它的化學(xué)成份中含有一種叫萘的化合物，該物質(zhì)具有偶氮結(jié)構(gòu)，由于這種化學(xué)結(jié)構(gòu)的性質(zhì)決定了它具有致癌性，對人體的肝腎器官具有明顯的毒性作用。蘇丹紅屬于化工染色劑，主要是用于石油、機(jī)油和其他的一些工業(yè)溶劑中，目的是使其增色，也用于鞋、地板等的增光。由于用蘇丹紅染色后的食品顏色鮮艷且不易褪色，一些不法食品企業(yè)把蘇丹紅作為色素添加到食品中。

食品中蘇丹紅染料分析方法有分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜法和氣相色譜質(zhì)譜法等。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19681-2005采用高效液相色譜-紫外法測定食品中的蘇丹紅，該方法靈敏度較低，在測定時需要切換掃描波長，不利于操作。熒光檢測法具有選擇性好、靈敏度高，檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，在分析科學(xué)及其它相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多，而蘇丹紅的熒光響應(yīng)較低，以熒光檢測法測定時需要對其進(jìn)行衍生，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^強(qiáng)熒光響應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

光化學(xué)反應(yīng)是待測物質(zhì)在可見光或紫外光的照射下而產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)，待測物質(zhì)的分子吸收光子后結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變或者與試劑產(chǎn)生反應(yīng)，導(dǎo)致化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，與化學(xué)衍生反應(yīng)相比，具有不需要使用額外的衍生試劑，污染較小，選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛的應(yīng)用于黃曲霉毒素的測定中，目前將光化學(xué)衍生應(yīng)用于蘇丹紅殘留測定的文章鮮見報道。

本文針對火鍋底料樣品，采用C18固相萃取柱對樣品進(jìn)行濃縮、凈化，建立了光化學(xué)衍生-高效液相色譜法同時測定火鍋底料中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B的方法，該方法具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

2 材料與方法

2.1 儀器及設(shè)備

高效液相色譜儀（主要包括熒光檢測器，柱溫箱，自動進(jìn)樣器等）；

光化學(xué)衍生器（由紫外燈、聚四氟乙烯反應(yīng)管組成）；超生波清洗器；離心機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；氮?dú)獯蹈蓛x；C18(500mg/6mL)固相萃取柱。

 2.2 試劑

乙腈、甲醇和丙酮，色譜純；無水硫酸鈉，分析純；實驗用水為Millpore超純水；

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：蘇丹紅Ⅰ(純度≥99.0%)，蘇丹紅Ⅱ(純度≥99.0%)，蘇丹紅Ⅲ(純度≥96.0%)，蘇丹紅B(純度≥90.0%)。

 2.3 分析測定條件

色譜柱： C18 (250mm×4.6mm ,5μm)；流動相A為乙腈，B為甲醇，梯度洗脫：0~11min，100% A；11~12min，100% A~0%A，0%B~100%B；12~25min，100% B；流速：0.8mL/min；進(jìn)樣體積：20μL；柱溫：30℃；熒光檢測器：激發(fā)波長310nm，發(fā)射波長348nm。

 2.4 樣品前處理

2.4.1 樣品的提取

稱取2.0g試樣于50.0mL離心管中，加入5.0g無水Na2SO4， 20.0mL丙酮-乙腈（V:V/2:8）溶液，超聲提取20min，以5000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至250mL雞心瓶中，殘留物用20.0mL丙酮-乙腈溶液重復(fù)提取一次，合并上清液，并在40℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1mL，待凈化。

2.4.2 固相萃取柱富集凈化

C18固相萃取柱依次用5mL乙腈、5mL水進(jìn)行活化和平衡，然后將上述待凈化液上樣過柱，用1mL丙酮-乙腈溶液潤洗雞心瓶，并將潤洗液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，用5mL水淋洗，再用5mL丙酮-乙腈溶液進(jìn)行洗脫，收集全部洗脫液，氮?dú)獯蹈桑帽?乙腈溶液重新定容至1mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

 2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B，加入少量丙酮超聲溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用乙腈稀釋成濃度為0.10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放置于4℃冰箱中避光保存。臨用前，分別準(zhǔn)確吸取一定體積的0.10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈逐級稀釋到相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3.結(jié)果與討論

 3.1 掃描波長的選擇

采用熒光檢測器自帶的3D掃描功能分別在波長200-340nm、330-600nm范圍內(nèi)掃描4種蘇丹紅光化學(xué)衍生產(chǎn)物的激發(fā)波長和發(fā)射波長，從掃描結(jié)果圖中看出，蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B經(jīng)光化學(xué)衍生后其衍生產(chǎn)物的最佳激發(fā)波長分別為312nm，312nm，305nm，305nm；最佳發(fā)射波長均為348nm，因此本文選擇激發(fā)波長310nm發(fā)射波長348nm作為掃描波長對4種蘇丹紅進(jìn)行同時測定。

 3.2檢測方法的選擇

分別采用熒光檢測器和柱后光化學(xué)衍生-熒光檢測器對相同濃度的4種蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，測定結(jié)果如圖2。從圖中可以看出，采用熒光檢測器測定時4種蘇丹紅僅表現(xiàn)出微弱的熒光響應(yīng)，不利于痕量組分含量的測定；經(jīng)光化學(xué)衍生后4種蘇丹紅的熒光響應(yīng)大為增加，這是由于蘇丹紅是一類萘酚偶氮結(jié)構(gòu)型染料，其分子結(jié)構(gòu)中的偶氮基團(tuán)具有光化學(xué)活性，在光照作用下能夠發(fā)生順式和反式結(jié)構(gòu)的互變，甚至能夠與溶劑發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致偶氮化合物的性質(zhì)發(fā)生顯著的變化，生成具有較強(qiáng)熒光響應(yīng)的物質(zhì)。

 3.3 流動相的選擇

分別以乙腈、甲醇、乙腈-水（V:V/98：2）、甲醇-水（V:V/98：2）、乙腈-甲醇（V:V/98：2）為流動相等度洗脫，光化學(xué)衍生后測定，考察4種蘇丹紅的出峰及分離情況。

以乙腈為流動相時，4種蘇丹紅均能產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光響應(yīng)，且4種蘇丹紅具有很好的分離度；以甲醇為流動相時，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ僅有微弱的熒光響應(yīng)，響應(yīng)值較低，難以滿足蘇丹紅殘留的檢測要求，蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅B具有較強(qiáng)的熒光響應(yīng)，與乙腈為流動相相比其響應(yīng)值更高；

以乙腈-水（V:V/98：2）、甲醇-水（V:V/98：2）、乙腈-甲醇（V:V/98：2）為流動相時，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ的熒光響應(yīng)均較弱，與未發(fā)生光化學(xué)衍生反應(yīng)測定的響應(yīng)值相近。

上述實驗表明蘇丹紅的光化學(xué)衍生反應(yīng)及反應(yīng)產(chǎn)物的熒光性質(zhì)與參加反應(yīng)的溶劑相關(guān)，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ在純乙腈條件下才能發(fā)生光化學(xué)衍生反應(yīng)，當(dāng)流動相中含有微量的水和甲醇時都會影響其光化學(xué)反應(yīng)；蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅B與甲醇和乙腈均能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，微量的水不影響這兩者的光化學(xué)反應(yīng)，而且在甲醇流動相中兩者的光化學(xué)衍生產(chǎn)物的熒光響應(yīng)值更高。

主要原因是隨著蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅B分子結(jié)構(gòu)中共軛體系的增大，分子極性減弱，從而在極性較弱的甲醇中表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。因此分別選擇乙腈和甲醇為光化學(xué)反應(yīng)的溶劑，采用梯度洗脫的方法對4種蘇丹紅進(jìn)行分離和測定。

 3.4 樣品前處理條件的選擇

現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)測定蘇丹紅時通常采用乙腈直接提取或者氧化鋁層析柱凈化的方法進(jìn)行樣品前處理，而前者容易受到樣品基質(zhì)的影響，提取后存在大量的干擾物質(zhì)，影響目標(biāo)物質(zhì)的定性和定量；后者處理方法較為繁瑣，氧化鋁的活性對方法回收率的影響很大。圖4為空白樣品和加標(biāo)樣品采用C18固相萃取柱凈化后測定的色譜圖。

實驗表明，C18固相萃取柱對4種蘇丹紅具有很好的保留作用，以水為淋洗液可以一次性去除樣品中大部分水溶性干擾物質(zhì)，減少雜質(zhì)對蘇丹紅檢測結(jié)果的影響，同時采用C18固相萃取柱進(jìn)行樣品前處理，對待測組分還具有濃縮和富集的作用，有利于降低待測組分的檢出限。

 3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

分別準(zhǔn)確吸取適量體積的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈逐級稀釋成一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述優(yōu)化的實驗條件進(jìn)行測定，以峰面積（y，μV·s）對質(zhì)量濃度(x，μg /mL)作圖，得線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)(R2)。向陰性火鍋底料樣品中添加低濃度水平的蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法進(jìn)行樣品前處理后上機(jī)檢測，以S/N=3為檢出限（LOD），S/N=10為定量限（LOQ）。

結(jié)果表明，采用外標(biāo)峰面積法定量，4種蘇丹紅在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999。與國標(biāo)方法相比，可較好地減少樣品濃縮、凈化等樣品前處理過程帶來的誤差，該方法線性范圍寬，檢出限低，可滿足實際樣品的檢測。

 3.6 回收率和精密度

向陰性火鍋底料樣品中分別加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并以上述實驗方法進(jìn)行樣品處理和測定, 考察實驗方法的回收率，并對加標(biāo)樣品重復(fù)測定6次，考察實驗方法的精密度。結(jié)果表明，蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B的回收率均在85%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.58%~4.36%。回收率和精密度結(jié)果編制成表。

4 結(jié)論

本文以C18固相萃取柱凈化樣品，富集蘇丹紅染料，并基于紫外光照射能夠增強(qiáng)蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B的熒光響應(yīng)，建立了光化學(xué)衍生-高效液相色譜法同時測定火鍋底料中4種蘇丹紅染料的方法。該方法能夠有效去除樣品中雜質(zhì)干擾，具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于火鍋底料中蘇丹紅殘留的分析檢測。

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